安徽大学考研，安徽大学考研分数线
应激颗粒（Stress granules，SGs）是细胞暴露于非生物应激（如热休克、氧化应激和缺氧）时细胞质中产生的RNA和蛋白质的无膜组装体。由于对新陈代谢和细胞信号的重要影响，SGs已被发现与包括癌症、神经退行性疾病和病毒感染在内的多种疾病密切相关。近年来，得益于荧光成像技术的飞速发展，人们对SGs的组成及其在疾病中的作用进行了研究。尽管如此，由于SGs结构的异质性和动态化，其精确结构和组装背后的机制仍然有待探索。由于目前的SG成像方法通常使用免疫荧光技术或荧光原位杂交方法，其成像试剂不仅需要复杂而繁琐的制备过程，而且仅限于分析SGs中的单个RNA（或蛋白质）组分，无法得到胞内RNA的全貌信息。鉴于SGs含有数千种不同序列的RNA，迫切需要人们设计和开发一种新型的具有高成像分辨率和活细胞兼容性的胞内全RNA成像试剂，进而为监控SGs的动态组装过程提供新的平台。
碳点(Carbon dots, CDs)是一类尺寸小于10 nm的新型碳纳米材料，由于其具有优异的光致发光性质在近年来受到研究者们的广泛关注。此外，CDs通常由石墨化的碳核和极性小分子修饰的壳层组成，此核-壳结构不仅使得CDs拥有生物相容性好、稳定性高等纳米碳材料的典型特征，而且吸纳了极性小分子的诸多优点(如水溶性、易修饰等)。因此，CDs应用于生物成像领域的研究方兴未艾，近年来人们报道了诸多具有特定细胞器和生物分子标记能力的CDs。尽管如此，由于RNA的结构多样性及其分布在核仁内的特点，对CDs的特异性和核孔渗透性要求较高，迄今具有RNA靶向能力的CDs报道仍然较少，而且目前还没有关于将CDs用于研究SGs精细结构和动态组装的报道。此外，对CDs的结构与其RNA特异性结合之间有何关联、以及CDs与RNA之间的具体相互作用的研究尚处于起步阶段，因此，合理设计具有高RNA选择性和成像分辨率的新型CDs荧光探针具有重要的研究意义。
为应对上述挑战，安徽大学材料科学与工程学院毕红教授课题组选择中性红和左氧氟沙星作为前驱体，通过微波辅助法合成了具有RNA靶向能力的红光发射CDs (M-CDs, 图1)。通过从源头上对CDs结构进行精准设计，实现了CDs与RNA的特异性结合以及对活细胞内SGs的高分辨成像和动态追踪。前驱体之一的中性红分子系苯胺衍生物，易聚合，且具有较大的sp2共轭平面，因而在反应中主要是生成碳核和发光中心。另一个前驱体即左氧氟沙星分子中有一个含氮杂环并易于质子化，且结构较稳定，与RNA的结合能力很强。其次，中性红分子含有氨基而左氧氟沙星分子中含有羧基，能够利用酰胺化反应使得左氧氟沙星分子在碳核表面形成壳层，从而作为RNA的特异性识别基元。
相关成果以“RNA-targeting carbon dots for live-cell imaging of granule dynamics”为题发表在期刊Advanced Materials上（Adv. Mater. 2023, DOI: 10100 / adma.202210776）。安徽大学化学与化工学院2021级的博士研究生蒋磊为该论文的第一作者，安徽大学材料科学与工程学院毕红教授、李子健副教授和中国科技大学生命科学学院张亮副研究员为本文的共同通讯作者。该工作得到了国家自然科学基金（52172033、51772001）和安徽省重点研发计划项目国际科技合作专项（202004b11020015）的资助。同时感谢中国科学技术大学生命科学实验中心的刘振邦老师、安徽大学健康科学与技术研究所的秦曦明教授和徐敏锐老师在生物成像上的帮助和支持。
图1. (a) M-CDs的合成、结构及其与RNA结合示意图。(b) M-CDs的细胞内化途径(从核糖体到核仁)及其用于细胞RNA成像的示意图。(c) HepG2细胞在正常(左)和应激(中)条件下与M-CDs共培养的激光共聚焦显微镜图像以及用M-CDs标记(右)的应激颗粒结构示意图。
核磁共振氢谱（图2c)、质谱和X-射线光电子能谱等分析结果证明了所合成的M-CDs具有上述核-壳结构和组成。该M-CDs不仅具有高RNA选择性，而且具有明亮的红色荧光（ λ max = 642 nm，量子产率( Φ PL) = 22.83%，图2d）。更为有趣的是，M-CDs与RNA结合时其荧光强度会进一步大幅提升（达2.1倍，图2e)，加上M-CDs的内在结构优点包括：小尺寸(1.6 nm，图2a与图2b)、高水溶性(> 4 mg mL -1)、生物相容性和化学稳定性，使得我们能够实时跟踪在活细胞中M-CDs的细胞内化途径，并高清、快速、免洗和选择性地“点亮”胞内RNA富集的相关区域(如内质网、核糖体和核仁，图2h)。进而通过Docking理论计算，研究了碳点与RNA的具体结合模式(图2f和图2g)，表明M-CDs表面的左氧氟沙星基元通过疏水和静电相互作用与RNA的发夹结构进行主客体络合。在此基础上，我们利用M-CDs对细胞在应激响应过程中的RNA动态分布进行高分辨时空成像(图2i)，不仅揭示了SGs结构的广泛异质性，而且发现了SGs组装的新特征，譬如除了主要的RNA/蛋白质相互作用以外，由RNA-RNA相互作用驱动的应激颗粒亦存在于SGs组装的早期阶段。
图2. (a) M-CDs的典型TEM(插图为对应的粒径分布直方图)和(b) HRTEM图像。(c) M-CDs的1H NMR谱。(d) M-CDs在水溶液中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱。(e)不同浓度RNA滴定时M-CDs的荧光光谱。(f, g) M-CDs(简化为表面含有左氧氟沙星基元)与riboRNA的分子对接计算图。(h) M-CDs与细胞不同共培养时间（0-30 s）下的活细胞工作站原位监测图像。(i) 在NaAsO2应激下细胞的免疫荧光染色的共聚焦图像。图i的最右边插图是相应的共定位区域放大图像，其中1-3分别表示由1)RNA和蛋白质、2)RNA、3)蛋白质组成的颗粒。
综上所述，一方面，尽管CDs在各个领域的应用蓬勃发展，但仍然缺乏自下而上对其结构和功能进行精准设计和控制的策略，本工作从源头开始设计，将前驱体结构与碳点功能进行高度关联，合成了具有高RNA选择性的红色荧光CDs，为设计功能集成化、模块化碳点材料提供了可借鉴的新思路。另一方面，本工作是首次将CDs作为RNA成像试剂用于细胞内SGs高分辨时空动态成像，揭示了SGs结构和组装的新特征，为原位观测细胞在应激条件下重塑RNA相关结构和动力学提供了全新的工具箱。
参考文献：
RNA-targeting carbon dots for live-cell imaging of granule dynamics, Lei Jiang, Hao Cai, W an wan Zhou, Zijian Li*, Liang Zhang * and Hong Bi*, Adv. Mater. 2023, DOI: 10100 / adma.202210776
【作者介绍】
安徽大学材料科学与工程学院毕红教授团队（http://mse.ahu.edu.cn/19480/list.htm）长期从事纳米生物材料的应用基础研究，近年来聚焦于荧光碳量子点材料的设计合成、结构和性能调控及其生物医学应用。迄今主持了国家自然科学基金面上项目 4 项和青年基金项目 1 项，以及省部级和企业委托开发项目等 10 余项。相关研究成果在Advanced Materials, Angewandte Chemie International Edition, Small 等国际高水平期刊上发表论文 130余篇，出版英文专著 2 本，被引 3800 余次，h-index 32（排除自引）。此外，获得 20项中国发明专利和 1 项荷兰发明专利授权。获安徽省级研究生教学名师、安徽省高校优秀拔尖人才等称号，担任安徽省抗癌协会第一届肿瘤光动力治疗专业委员会常务委员和中国抗癌协会肿瘤光动力治疗专委会常务委员。
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https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202210776
来源：BioMed科技
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