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蛋白纳米膜显著改善尿道狭窄
尿道狭窄继发于尿道损伤，是由粘膜下和尿道周围组织的过度沉积引起的，困扰着患者和泌尿科医生。虽然各种抗纤维化药物已通过冲洗或粘膜下注射应用于尿道狭窄，但其临床可行性和有效性有限。因此，陕西师范大学杨鹏教授/西安交大二附院种铁教授为了靶向细胞外基质的病理状态，设计了一种基于蛋白质的纳米膜控制的药物传递系统，并将其组装在导管上，这种方法将良好的抗生物膜特性与稳定的数十天控制的给药相结合，确保了在预防生物膜相关感染的同时，副作用可忽略不计。在兔尿道损伤模型中，抗纤维化导尿管通过减少成纤维细胞来源的胶原的产生和增强金属蛋白酶1诱导的胶原降解来维持细胞外基质稳态，比其他局部治疗更改善尿道狭窄。这种具有抗菌污染和药物缓释功能的简易生物相容性涂层不仅有利于尿道狭窄高危人群，而且可以作为一系列生物医学应用的先进范例。研究成果以“Rectifying disorder of extracellular matrix to suppress urethral stricture by protein nanofilm-controlled drug delivery from urinary catheter”为题于2023年5月17日发表在《Nature Communications》上。
兔尿道损伤模型确定通过平衡损伤愈合过程中ECM的沉积和降解，从导管局部给予抗纤维化药物（雷帕霉素）可使管腔减少从51.8降低到10.8%（图1）。
图1 为有效预防尿道狭窄而安装在导尿管上的夹层式给药平台示意图
【混合PTB@SA纳米膜的一锅合成】
将材料浸没在将BSA和海藻酸钠（SA）预混，然后加入TCEP水溶液（pH=4.5）的相变溶液中来实现表面改性（图2a）。在疏水相互作用的驱动下，得到直径为12-16nm的β-sheet堆积蛋白颗粒在固液界面自组装形成纳米膜（图2b）。混合纳米膜内被三个纳米颗粒包围的孔隙的尺寸为1.86-2.48nm，这与BET测试所反映的约2.16 nm的测量结果一致（图2c）。圆二色性（CD）反映在相变过程中，BSA二级结构从α-螺旋到β-sheet的变化（图2d）。采用硫黄素T（ThT）和刚果红与β-sheet的结合，进一步证实了在相变过程中β-sheet结构的积累，以及硅橡胶（SR）导管/薄片上混合涂层的成功修饰（图2e）。SA在纳米薄膜中分布均匀（图2f），其封装密度也随加入比的增加而增加（图2g），说明SA成功地融入纳米膜中。脂肪族碳（C-C/C-H）、胺（C-N）、羟基（C-O）、酰胺（O=C-N）、硫醇（C-S）和羧基（O=C-O）官能团为纳米膜与底层底物提供了多重界面键合位点（图2h)。对PEEK、SER、PVC、PC、PET、Si、Al2O3、Ti和SLL表面的水接触角（WCA）测量显示，WCA一致约80°（图2i），这也意味着混合纳米膜对多功能基质的成功修饰。经过处理后，纳米膜厚度在50 nm左右不变，表明混合纳米膜具有良好的鲁棒性，这对实际生产和应用非常重要（图2j）。
图2 混合涂层的制备与稳定性
【在PTB@SA纳米膜中的超分子相互作用和韧性增强】
未展开的蛋白链与SA之间的联系主要是通过静电相互作用和氢键作用（图3a）。不同SA含量的混合纳米膜中游离羟基的比例明显低于纯SA和SA与天然BSA的混合物（图3b)。QCM-D进一步证明，ΔD/ΔF吸收PTB@SA的斜率比PTB胶体和天然BSA陡峭得多（图3c）。与PTB纳米薄膜相比，杂化纳米薄膜的韧性和断裂应力分别提高了约6倍和4倍（图3d、e）。这种韧性的提高伴随着压痕深度增加50%，弹性模量减少52.4%，硬度降低55.8%（图3f、g）。如图3h–k所示，SR上的PTB@SA涂层向内或向外弯300次后保持完整，而纯PTB涂层上出现深而宽的裂纹。以上结果表明混合纳米膜比PTB更适合构建药物传递平台，因为没有断裂或分离的涂层植入表面，相应的泄漏封装药物和相关的危险系统暴露不容易发生。
图3 提高了混合涂层的韧性和机械稳定性
【抗菌生物膜的形成及生物相容性评价】
PTB@SA纳米膜表现出较低的负表面zeta电位（图4a），因此可以保持良好的抗菌膜能力。与未修饰的底物相比，混合涂层使金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）的定植分别减少了96和99%以上（图4b、c）。将微图案的混合涂层暴露于细菌悬浮液后，SYTO 9染色显示几乎没有细菌粘附在PTB@SA涂层区域（图4d、e）。在最后7天的导管期间，原始SR导管的表面被密集的大肠杆菌生物膜覆盖，而只有少数细菌分散在混合纳米膜涂层导管（图4f、g），显示体内抗生物膜效率超过87%（图4h）。用纳米膜改良导尿管处理的家兔尿白细胞数量也明显低于对照组（图4i)。从宏观上看，对照组出现尿道充血、水肿（图4j)。如图4k所示，对照组核浆比高的细胞（可能为炎症细胞）的浸润面积是涂层组的10倍（图4k、l）。混合纳米膜修饰导致上皮层的炎症反应，而更多的炎症细胞浸润对照组的黏膜和粘膜下层（图4k、m）。因此，这种具有强大的抗生物膜特性的混合纳米膜非常适合于设计安装在导尿管上的局部药物传递系统，以调节组织愈合。
图4 混合涂层的抗生物膜性能和生物相容性
【通过在固体药物库上形成释放速率控制膜，使药物固定化和控制释放】
从这种固体储层系统中释放的药物涉及药物颗粒溶为溶剂化分子，随后的浓度梯度驱动药物分子通过PTB@SA纳米膜内紧密排列的生物聚合物纳米颗粒之间的空隙扩散（图5a）。作为对照，将溶解在释放介质中的等量的雷帕霉素分子应用于膜的空气侧，作为恒定活性的来源（图5b）。随着没有预溶剂步骤的药物直接扩散，雷帕霉素从非恒温液库中释放遵循一级分布，并在19 h后达到平衡（图5c）。19 h后只有27.3%的雷帕霉素从固体库渗透到膜，10 h后的释放曲线遵循零级释放（图5d）。
通过进一步设计一个夹层状结构，将雷帕霉素固定在纳米膜内，将抗生物膜特性和抗纤维化活性整合到常规导尿管中（图6a-c）。在固体药物库周围形成混合PTB@SA纳米膜，将固体药物芯包裹在导管上，作为释放速率控制膜（图6d)。在药物释放过程中，扫描电镜追踪给药系统形态的变化可以清楚地反映出固体核心库的持续消耗（图6e）。由于混合纳米膜中SA和PTB之间的分子间氢键降低了游离亲水基团和相应的溶剂吸收，PTB@SA纳米膜的膨胀率明显低于PTB（图6f）。在释放速率控制膜中加入SA延缓了溶剂通过膜的渗透步骤，这反映在水渗透性降低（图6g）。用更灵活的PTB@SA纳米膜替代PTB，避免了由变形引起的裂纹引起的不良药物泄露（图6h）。直到第30天，PTB@SA纳米膜中仍释放1.52%，而PTB系统在14天后每天载药量少于1%（图6i）。由PTB@SA纳米膜控制的雷帕霉素给药策略在整个释放过程中显示出了比较良好的释放速率（图6j、k）。通过不同的动力学模型来拟合释放模式（图6l）。培养原代大鼠尿道成纤维细胞，并分别将缓释涂层浸入细胞培养基中24 h或72 h获得的不同提取物检测其增殖情况（图6m）。上述结果证实了该药物传递系统通过抑制成纤维细胞的增殖在细胞水平上的有效性及其在纤维化疾病中进一步应用的潜力。
图5 从储层型系统中释放药物的机制
图6 构建医疗体释放速率控制膜覆盖固体药物库模型的夹层状结构设计
【雷帕霉素载导尿管通过调节损伤后ECM代谢抑制尿道狭窄】
抗纤维化导管（即PTB@SA-雷帕霉素导管）可使管腔从51.8%（未改良导管）降低至10.8%（图7a、b）。管腔狭窄的平均改善百分比为79.2%，这表明与其他局部给药方案相比，PTB@SA-雷帕霉素导尿管在预防尿道狭窄方面具有潜在的巨大优势（图7c）。PTB@SA-雷帕霉素导管通过减少成纤维细胞来源的胶原产生，增强MMP-1诱导的胶原降解，降低粘膜下胶原的水平，从而改善ECM紊乱（图7d、e）。全身给药组的ALT和AST增加到初始水平的两倍（图7f、g），相应的肝组织染色显示肝细胞球囊化和肝细胞损伤（图7h），这是一个与全身给予雷帕霉素相关的不良事件。
图7 导尿管上雷帕霉素缓释涂层可减轻胶原沉积，抑制尿道损伤后狭窄的形成
【总结】
总之，在界面上使用由生物聚合物纳米颗粒组装的多糖-蛋白混合纳米膜的抗纤维化导尿管在预防尿道狭窄和导尿管相关的尿路感染方面具有相当大的治疗效益。在这种混合纳米膜中，SA和未折叠蛋白链之间的超分子相互作用的整合显著提高了韧性，并与其他多个有利性能精细耦合，通常包括在各种表面上的强健粘附、优良的抗生物膜特性和固有存在于形成的混合纳米膜中的纳米通道。因此，这种混合纳米膜被认为是在医疗材料上构建缓释药物传递涂层的一个很有前途的候选材料。利用混合纳米膜来固定固体药物储层，形成一个具有恒定活性源的夹层状固体储层系统，以稳定地释放抗纤维化药物至少数十天。因此，传统的导尿管在一步制备过程中被巧妙地赋予抗纤维化和抗生物膜的特性。本研究不仅为以ECM代谢紊乱为特征的良性管腔狭窄的治疗开辟了一条线索，还提出了一种基于简易蛋白纳米膜涂层、强大的界面结合和可控分子释放的种植体表面功能化的放大策略。
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https://doi.org/10.1038/s41467-023-38282-2
来源：高分子科学前沿
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